ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МАГНИТНОЙ СЕПАРАЦИИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ИЗ КЛИНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

_И.И. Кузьмин, И.Ф. Ахтямов, Р.И. Кузьмин_

Казанский государственный медицинский университет, Приморская краевая клиническая больница, Владивосток, Россия.

Способ выделения генетического материала имеет решающее значение для успеха клинического применения методов молекулярной диагностики.

Используемые в молекулярной генодиагностике амплификационные методы, наиболее распространенньми среди которых является полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладают достаточной чувствительностью для определения единичных копий исследуемого гена.

Главная проблема, возникающая при внедрении этих методов, в клиническую практику заключается в необходимости выделения исследуемого генетического материала из самых разнообразных биологических субстратов.

Наибольшую сложность представляет ингибирование амплификационных реакций различными компонентами, содержащимися в биосубстратах. Наличие ингибиторного эффекта сильно снижает чувствительность реакции или делает ее успешное проведение вообще невозможными. Проблема ингибиторного эффекта особенно трудна для решения в клинической практике, поскольку ингибиторами могут быть самые различные вещества. Точная природа и механизм ингибиторного эффекта неизвестны, и проведение таких исследований сильно затруднено вследствие неспецифичности взаимодействий лежащих в его основе. В целом можно определить ингибиторный эффект как влияние различных компонентов реакционной смеси на активность полимеразных ферментов. Ингибиторное действие могут оказывать самые различные компоненты, встречающиеся в биосубстратах и неспецифически связывающиеся с полимеразой, блокирующие ее активность. Это главным образом сложные высокомолекулярные комплексы, состоящие как из биополимеров, составляющих компоненты межклеточного матрикса и многих биологических субстратов, таких как мокрота и синовиальная жидкость, так и комплексы денатурированных белков. Ингибиторный эффект особенно неблагоприятен своей непредсказуемостью, поскольку сильно зависит от состава конкретного субстрата. Поэтому единственным направлением для успешного внедрения методов молекулярной генодиагностики в клиническую практику является применение такого способа выделения изучаемого генетического материала из исследуемого субстрата, который позволил бы осуществлять селективное извлечение необходимой нуклеотидной последовательности и полное удаление всех других компонентов, включая все возможные ингибиторы.

Наиболее эффективным на сегодняшний день является метод магнитной сепарации. Он осуществляется следующим образом: к субстрату после его денатурации, проводящей к высвобождению в раствор генетического материала, добавляется небольшое количество олигонуклеотидов, комплементарных исследуемым последовательностям. Наиболее целесообразно использовать для этой цели один из каждой пары праймеров. К 5' концу этих олигонуклеотидов присоединен биотин. После денатурации исследуемого генетического материала, разрушающего его вторичную структуру, добавленные олигонуклеотиды специфически гибридизируются с комплементарными им участками исследуемых последовательностей. Эффективность гибридизации обеспечивается большим избытком олигонуклеотидов по отношению к выделяемой последовательности и проведением реакции в жидкой фазе. К полученному раствору добавляются магнитные микросферы, покрытые стрептавидином, прочно и специфично связывающим биотинилированные олигонуклеотиды с присоединяющимися к ним изучаемыми последовательностями. Микросферы после этого осаждаются из раствора под действием магнитного поля создаваемого мощньми магнитами, вмонтированными в специальные штативы. Такие иммобилизованные микросферы тщательно промываются, что обеспечивает полное удаление всех не связавшихся с микросферами компонентов, включая любые возможные ингибиторы. Обнаруживаемая последовательность при этом остается прочно связанной с микросферами. Микросферы вместе с иммобилизованными на них изучаемыми последовательностями непосредственно вносятся в реакционную систему для ПЦР, поскольку они не оказывают ингибиторного эффекта. Таким образом, метод магнитной сепарации позволяет осуществлять специфическое извлечение исследуемых последовательностей из большого (до 1 мл) объема любого клинического материала. Использование этого метода позволит внедрить методы молекулярной генодиагностики в широкую клиническую практику.